柑橘作为我国重要的经济作物，种植面积和产量均居世界第一，其风味独特，营养丰富，深受广大消费者的喜爱。但柑橘在采后极易受到指状青霉（

　　Penicillium digitatum）、意大利青霉（P.italicum）、酸腐病菌（Geotrichum citri-aurantii）等采后致病真菌的侵染。环境pH值对病原真菌的生长发育和代谢具有一定调控作用，而病原真菌对环境pH值也具有一定的适应和调节能力。其中，由转录因子PacC介导的pH值信号响应途径在微生物中广泛存在，调控多种植物病原真菌的环境适应性、次级代谢和致病性。

　　湘潭大学化工学院的郑杰、谭小丽、李路*等首先研究不同pH值对酸腐病菌生长的影响，在全基因组水平筛选酸腐病菌

　　PacC序列的信息，对其亲缘关系、基因及其编码的蛋白质结构进行预测，随后测定其在不同pH值以及果实侵染过程中的表达模式，以期为进一步研究柑橘酸腐病菌的致病机理奠定基础。

　　PacC候选基因PacC1PacC2。它们与白地霉PacC基因同源性分别高达76.7%和74.7%，可能具备PacC相似功能，因此，后续对这两个基因进行生物信息学和表达模式分析。

　　PacC1PacC2亲缘关系最近。测试物种中，与指状青霉（P.digitatum）、产黄青霉（P.chrysogenum）以及黑曲霉（A.niger）的亲缘关系较近，与酿酒酵母（S.cerevisiae）、白色念珠菌（C.albicans）等物种的亲缘关系较远（图3）。

　　由图6可知，PacC1与PacC2的蛋白结构具有一定差异。对其理化性质进行分析，发现PacC1与PacC2均为亲水性的不稳定蛋白，没有跨膜位点与信号肽，WoLF PSORT亚细胞定位显示二者均在细胞核内发挥功能调控作用。它们在分子质量、等电点、磷酸化位点等方面存在一定差异。其中，PacC1蛋白对应碱基数为1 872 bp，编码623 个氨基酸，PacC1分子质量为67.80 kDa，等电点为6.71，可能发生磷酸化的位点有Ser56、Thr18、Tyr8；PacC2蛋白对应含1 779 个碱基，编码592 个氨基酸，PacC2分子质量为64.32 kDa，等电点为8.50，Ser72、Thr18、Tyr13位点可能发生磷酸化（表2）。PacC1和PacC2蛋白高级结构预测见图6。

　　如图7所示，酸腐病菌在pH 2.0～11.0范围内均能生长，其中pH 3.0菌丝生长量显著高于其他pH值，其次是pH 4.0。在pH 2.5和pH 5.0～10.0范围内菌丝生长量没有显著差异。pH 2.2和11.0菌丝生长受到显著抑制，在pH＜2.2时几乎不生长。由此可知，pH值对酸腐病菌的生长具有调控作用，酸腐病菌具有广泛的pH值适应性，但其最适生长pH值约为3.0，这与许多柑橘品种果实pH值接近 。

　　PacC1PacC2的表达均受pH值调控，且两个基因的表达变化趋势具有一定相似性。处理1 h时，PacC1PacC2表达均在pH 11.0显著上调（P＜0.05），相对表达量分别约为对照的2.24 倍和1.62 倍；PacC1表达量在其他pH值条件下没有显著差异，但PacC2在pH 1.0时几乎不表达（图8）。处理24 h时，PacC1PacC2表达量在pH 9.0和pH 11.0均显著上调，其中pH 9.0处理中的两个基因表达量均约为对照的4.8 倍，PacC1在pH 11.0的表达量约为对照的8.5 倍，而PacC2的上调倍数更高，约为对照的13 倍，两个基因在其他pH值的表达水平相似，但pH 1.0时PacC2的表达量显著上调。3 PacC在酸腐病菌侵染柑橘果实侵染过程中的表达情况

　　宫川蜜橘果实人工接种酸腐病菌2 d时，果实伤口处可见明显软腐症状，病斑直径为（1.97±0.13）cm，4 d出现白色霉层，病斑直径达到（3.88±0.06）cm，至发病6 d时，果实几乎完全腐烂（图9A、B）。果实发病过程中腐烂部位的pH值呈下降趋势，在6 d时下降约0.2，显著低于对照（图9C）。酸腐病菌两个

　　PacC2的表达量在6 d才有显著上调（图9C）。尤力克柠檬果实人工接种酸腐病菌2 d时，果实伤口处也可见明显软腐症状，病斑直径为（1.92±0.14）cm，4 d时软腐面积加大，病斑直径为（3.80±0.05）cm，至发病6 d时果实几乎被白色霉层覆盖，完全腐烂（图10A、B），发病过程中腐烂部位的pH值呈上升趋势，至接种6 d时上升约0.4，显著高于对照（图10C）。酸腐病菌两个PacC的表达量均在侵染6 d时发生显著上调（图10C）。采后病原真菌的侵染能力受寄主伤口、温度、湿度和环境pH值等因素的影响，其中环境pH值对病原真菌的生长和致病力有重要调控作用。许多病原真菌通过调整对微量元素的利用和体内一些蛋白质的功能应对环境pH值的变化，因此具有广泛pH值适应性。目前，丝状真菌中报道较多的pH值响应机制为pal途径，该途径包含7 个基因：pacC

　　palApalBpalCpalFpalHpalI，其中，PacC作为重要的环境pH值调节因子，在微生物调节、适应环境的过程中发挥重要作用。PacC的结构高度保守，PacC蛋白属于C 2H 2蛋白家族，含有3 个保守的Cys 2His 2锌指蛋白结构域。采后致病真菌中，意大利青霉和指状青霉PacC均具有此结构。此实验对酸腐病菌候选PacC的氨基酸序列和保守基序进行分析，发现2 个候选基因均具有PacC的保守结构，且系统发育树也表明其亲缘关系与柑橘采后致病菌指状青霉较近，说明其可能与指状青霉PacC具有类似功能。指状青霉同样是嗜酸真菌，在侵染柑橘果实过程中PacC表达水平呈显著上调，且可能参与酸分泌过程改变环境pH值，PacC功能的缺失可导致病菌致病性显著下降。此外，指状青霉PacC在离体碱性条件下有高水平表达，对指状青霉的环境适应性有重要意义。因此，推测酸腐病菌PacC在柑橘果实致病性和病原菌环境适应性中可能具有重要调控作用。进一步对酸腐病菌两个PacC的结构和性质进行分析，发现PacC1PacC2位于不同染色体（图5），在等电点和磷酸化位点等方面有较大差异（表2），推测这两个基因在功能上也存在一定差异。不同的寄主组织存在显著性的pH值差异，不同病原菌生长的适宜pH值及耐受范围也存在较大差异。本实验中，离体条件下，柑橘酸腐病菌具有较广的pH值适应能力，但pH 3.0～4.0范围的生长量显著高于其他pH值（图7），而其寄主pH值范围大多约为2.0～6.0，其中柠檬类果实pH值约为2.2，宽皮柑橘类果实pH值约为3.0，甜橙类果实pH值约为5.0。因此，推测酸腐病菌在宽皮柑橘类果实中具有更强的生长能力，而实际上，酸腐病菌对pH值极低的柠檬果实也有较强侵染力，这可能与其pH值调节能力有关。大量研究表明，中性到碱性条件下，

　　PacC缺失突变体在碱性环境中无法生长，对果胶的利用能力和柑橘的致病性也大幅下降。但是PacC在酸性条件下的表达模式不尽相同。此实验中，离体条件下培养的酸腐病菌从最适生长pH 3.0培养基转移到不同pH值培养基中继续培养1 h时，PacC1PacC2均能对环境pH值进行迅速响应，在显著抑制菌丝生长的pH 11.0处理中表达迅速上调（图8），培养24 h时，两个PacC的表达量在pH 9.0和pH 11.0的处理中均显著上调，且pH 11.0处理中表达量更高（图8），说明碱性环境能诱导酸腐病菌PacC的高水平表达，这与上述采后致病菌PacC的表达情况一致。值得注意的是，PacC1PacC2在某些酸性条件下的表达趋势有显著差异，如pH 1.0处理1 h，PacC2的表达被显著抑制，同样，PacC2的表达水平在pH 3.0处理24 h也显著下降，而PacC1的表达未发生显著变化（图8），说明酸腐病菌PacC的表达也受酸性环境调控，可能在侵染柑橘果实过程中也有类似情况，而这两个基因呈现出不同的响应模式可能与其结构和性质的差异相关。在侵染初期，采后病原真菌通常分泌酸或碱以调节侵染位点pH值以加速侵染进程，这一过程可能与PacC

　　PacC缺失株侵染葡萄时不再分泌葡萄糖酸和柠檬酸；核盘病菌（Sclerotinia sclerotiorumPacC直接调控草酸的分泌降低侵染位点pH值。胶胞炭疽菌（C.gloeosporioides）可在鳄梨组织中分泌氨，进而导致侵染位点pH值升高。此实验中，人工接种酸腐病菌的宫川蜜橘和尤力克柠檬果实侵染位点pH值的变化呈相反趋势。宫川蜜橘果实初始pH值约为3.30，随着病斑面积的扩大，发病部位的pH值逐渐下降至3.11，说明酸腐病菌与宫川蜜橘果实互作过程中的产物可导致果实腐烂部位pH值的下降，有利于病原菌的扩繁。接种后4～6 d果实病斑面积急剧增大，同时酸腐病菌PacC的表达量也上调，说明酸腐病菌PacC很可能参与对环境pH值的调控，从而促进侵染进程。PacC在酸腐病菌侵染尤力克柠檬果实过程中也发挥类似作用，但侵染位点pH值呈上升趋势。虽然不同品种果实发病部位pH值的变化趋势不同，但发病后期的组织pH值均更接近酸腐病菌生长的最适pH值。结 论

　　本文《柑橘酸腐病菌PacC的生物信息学分析及其响应pH值的表达模式》来源于《食品科学》2023年44卷第22期108-115页，作者：郑杰，谭小丽，胡近近，陶能国，欧阳秋丽，李茂。